单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验七 猪圆环病毒病,PCR,诊断,实验目的：,1,、了解,PCR,反应的原理、方法及操作步骤；,2,、掌握猪圆环病毒,PCR,检测的方法；,实验内容：,1,、讲述,PCR,反应的原理、方法及操作步骤，,2,、猪细小病毒,PCR,检测。,什么是,PCR,？,聚合酶链式反应（,Polymerase Chain Reaction,，简称,PCR,）又称无细胞分子克隆或特异性,DNA,序列体外引物定向酶促扩增技术。,一、,PCR,反应的原理、方法及操作步骤,PCR,原理,PCR,是一种选择性扩增,DNA,或,RNA,的方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中的,DNA,半保留复制机理，以及在体外,DNA,分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链,DNA,变成单链；单链,DNA,与人工合成的引物退火，以及在,dNTP,存在下，耐高温的,DNA,聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链,DNA,。高温变性，低温退火，适温延伸等步反应循环进行，使目的,DNA,得以迅速扩增。,PCR,原理,PCR,技术在模板,DNA,、,dNTP,、,Mg2+,、合适,Buffer,等条件下，用耐热的,Taq,聚合酶代替,DNA,聚合酶，用合成的,DNA,引物代替,RNA,引物，经过,DNA,变性、引物与模板结合（复性）和延伸,3,个步骤的反复循环（,25,30,次）过程，使目的,DNA,呈指数,扩增。,反应程序,变性：,93-94 2min,变性：,93-94 30s,复性：,55-65 30s,延伸：,72 30s,延伸：,72 2min,35,个循环,PCR,原理,Sample denaturatation,Primer annealing,Primer extension,PCR product,标准的,PCR,反应体系,10,扩增缓冲液,10ul 4,种,dNTP,混合物 各,200umol/L,引物,10,100pmol,模板,DNA 0.1,2ug Taq DNA,聚合酶,2.5u Mg,2+,1.5mmol/L,加双或三蒸水至,100ul,酶及其浓度,目前有两种,Taq DNA,聚合酶供应,天然酶：从栖热水生杆菌中提纯,基因工程酶：大肠菌合成,一个典型的,PCR,反应约需酶量,2.5U,（,指总反应体积为,100,ul,时）,浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少,引物,引物是,PCR,特异性反应的关键,PCR,产物的特异性取决于引物与模板,DNA,互补的程度,理论上，只要知道任何一段模板,DNA,序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用,PCR,就可将模板,DNA,在体外大量扩增,引物在线设计网址：,http:/www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/,primer/primer3_www.cgi,PCR,产物分析,凝胶电泳分析法,可用琼脂糖（,Agrose,）或聚丙烯酰胺（,PAGE,）凝胶电泳检测,PCR,扩增产物的大小。,同时应以标准,DNA,分子量作平行对照，凝胶中加入溴化乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。,二 猪圆环病毒感染,PCR,检测,-,试剂盒,圆环病毒,（,PCV,）,使用方法,注意事项：,作业,1,、叙述,PCR,反应的原理、操作方法及注意事项。,2,、叙述猪圆环病毒感染,PCR,检测的方法及结果判定。,