单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,课题,2,：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,课题2：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,导入新课,上一节课我们已经学习了培养基的配制以及接种技术，现在我们就来学习如何从土壤中将我们需要的微生物进行分离。,土壤,微生物,导入新课 上一节课我们已经学习了培养基的配制以及,尿素,是一种重要的农业氮肥，分子式为,H,2,NCONH,2,，不能直接被农作物吸收。,尿素是一种重要的农业氮肥，分子式为H2NCONH2，不能直接,土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,原因,:,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成,脲酶,CO(NH,2,),2,+H,2,O,脲酶,CO,2,+2NH,3,土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。原因:土壤中的,一、研究思路,二、实验设计,三、结果分析与评价,四、课题延伸,一、研究思路二、实验设计三、结果分析与评价四、课题延伸,你能想一想怎样能将分解尿素的细菌从土壤中分离出来吗？,想一想,你能想一想怎样能将分解尿素的细菌从土壤中分离出,（一）筛选菌株,一 研究思路,耐热微生物,温泉,耐寒微生物,冰川,（一）筛选菌株一 研究思路耐热微生物温泉耐寒微生物冰川,分解石油的细菌,油田,筛选原则：,根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,分解石油的细菌油田筛选原则：,实例：,Taq DNA,聚合酶的发现,DNA,多聚酶链式反应是一种在体外将少量,DNA,大量复制的技术。此项技术的自动化，要求使用耐高温的,DNA,聚合酶，该去哪里寻找？,科学家是从水生耐热细菌,Taq,中分离到耐高温的,Taq DNA,聚合酶,的。,美国黄石国家公园的一个热泉,实例：Taq DNA聚合酶的发现 DNA多聚酶,2,、选择培养基,定义,允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，叫做选择培养基。,2、选择培养基 定义 允许特定种类的微生物生长，,选择培养基配方,在左图的培养基配方中，碳源和氮源分别是什么？,碳源,葡萄糖、尿素,氮源,尿素,选择培养基配方 在左图的培养基配方中，碳源和氮,1,、显微镜直接计数：,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,不能区分死菌与活菌；,个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点,（二）统计菌落的数目,1、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一,2,、稀释涂布平板法（活菌计数法）,原理：,当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。,恰当的稀释度是成功统计菌落数目的关键。,2、稀释涂布平板法（活菌计数法）原理：恰当的稀释度是成功统计,样品稀释培养示意图,选,30300,个菌落的平板统计。,每个稀释度取,3,个平板取其平均值。,统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,样品稀释培养示意图选 30300 个菌落的平板统计。,每克样品中的菌落数,(CV)M,C,代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，,V,代表涂布平板时所用的稀释液的体积,(ml),，,M,代表稀释倍数。,每克样品中的菌落数(CV)M,是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,（三）设置对照：,（,1,）设置对照的目的：,（,2,）对照实验：,指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。,实验组：,对照组：,设置对照,-,同等条件下，培养空白培养基。,菌落计数,配制土壤溶液,系列稀释,涂布平板与培养,是排除实验组中非测试,实例：,在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，,A,同学,从对应的,10,6,倍稀释的培养基中筛选出大约,150,个菌落，但是,其他同学,在同样的稀释度下只选择出大约,50,个菌落。分析其原因。,原因：,土样不同，,培养基污染或操作失误,(,或者是混入了其他的含氮物质,),实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时,小结：,通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案一：,由其他同学用与,A,同学相同土样进行实验,方案二：,将,A,同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：,如果结果与,A,同学一致，则证明,A,无误；如果结果不同，则证明,A,同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,小结：方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验 方案二：,二 实验设计,菌落计数,配制土壤溶液,系列稀释,涂布平板与培养,土壤中细菌分离与计数示意图,二 实验设计菌落计数配制土壤溶液系列稀释涂布平板与培养土壤中,实验具体操作步骤：,1,、土壤取样,从富含有机物、潮湿、酸碱度适中的土壤中取样。铲去表层土,3cm,左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。,“微生物的天然培养基”,数量最大、种类最多,大约,70%90%,是细菌,实验具体操作步骤：1、土壤取样“微生物的天然培养基”数量最大,制备选择培养基（尿素为唯一氮源）,制备牛肉膏蛋白胨培养基,（对照作用）,思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？,2,、制备培养基,制备选择培养基（尿素为唯一氮源）（对照作用）思考？为什么还要,3,、样品的稀释,分离不同的微生物采用不同的稀释度,原因：,不同微生物在土壤中含量不同,目的：,保证获得菌落数在,30,300,之间、适于计数的平板,（,1,）测细菌数：一般用,10,4,、,10,5,、,10,6,稀释液,（,2,）测放线菌：一般用,10,3,、,10,4,、,10,5,稀释液,（,3,）测真菌数：一般用,10,2,、,10,3,、,10,4,稀释液,3、样品的稀释分离不同的微生物采用不同的稀释度（1）测细菌数,按浓度捆成一摞,恒温,37,培养,4,、微生物的培养与观察,培养不同微生物往往需要不同培养温度。,细菌：,30,37,培养,1,2d,放线菌：,25,28,培养,5,7d,霉菌：,25,28,的温度下培养,3,4d,。,按浓度捆成一摞恒温37培养4、微生物的培养与观察培养不同微,观 察,1,、在菌落计数时，每隔,24h,统计一次菌落数目。,选取菌落数目稳定时的记录作为结果，,这样以防止,因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目,。,2,、以“稳定菌落”为观察对象。,原因：不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，,菌落特征,可作为菌种鉴定的重要依据。,观 察 1、在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。,不同形态的菌落,不同形态的菌落,不同形态的菌落,不同形态的菌落,（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落,对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。,（二）样品的稀释操作是否成功,如果得到了,2,个或,2,个以上菌落数目在,30,300,的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。,（三）重复组的结果是否一致,如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，教师需要引导学生一起分析产生差异的原因。,结果分析与评价,（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落结果,课题延伸,pH,升高,指示剂（酚红）将变红,CO(NH,2,),2,+H,2,O,脲酶,CO,2,+2NH,3,课题延伸pH升高CO(NH2)2+H2O脲酶CO2+2NH3,研究思路,实验设计,筛选菌株,选择培养,筛选原则,统计菌落数目,操作提示,无菌操作,做好标记,选择培养基,定义,配方,目的,定义,土壤取样,配制培养基,制定计划,结果分析与评价,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,设置对照,微生物培养与观察,细菌的计数,课堂小结,研究思路实验设计筛选菌株选择培养筛选原则统计菌落数目操作提示,