单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程药物,-干扰素的制备,1,基因工程药物1,1,什么是干扰素,概念,(interferon,IFN),：机体免疫细胞产生的一类细胞因子，是机体受到病毒感染时，免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。,根据分子结构和抗原性的差异分为,、,、,、,等,4,个类型。,2,1 什么是干扰素概念(interferon,IFN)：机体免,1.1,天然干扰素的分类,1.,根据来源、基因序列和氨基酸组成分类,I,型干扰素：,IFN,、,IFN,、,IFN,、,IFN,来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等,功能：抗病毒感染、抗肿瘤生长、免疫调节,(,较弱）,其中,IFN-,为多基因产物，有,23,种以上的亚型。,II,型干扰素：干扰素,（,IFN,),来源：活化的,T,细胞和,NK,细胞产生,功能：免疫调节,3,1.1天然干扰素的分类 1.根据来源、基因序列和氨基酸组,提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强,Tc,细胞和,NK,细胞的杀伤活性 抑制,TH2,细胞形成，下调体液免疫应答 趋化作用 抗病毒和抗肿瘤作用（次要）,2.,根据动物来源确定分类 人干扰素（,HuIFN,），小鼠干扰素（,MuIFN,）。,4,提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力,不同来源的干扰素,5,5,1.2,重组干扰素的临床应用,广谱抗病毒活性（,rhuIFN,）,慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。,直接抗肿瘤活性（,rhuIFN,）,毛细胞和慢性髓样白血病、,Kaposi,肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。,免疫调节活性,治疗慢性肉芽肿瘤（,rhuIFN,）,多发性硬化症,rhuIFN,6,1.2 重组干扰素的临床应用广谱抗病毒活性（rhuIFN）,2,基因工程大肠杆菌发酵生产工艺,7,2 基因工程大肠杆菌发酵生产工艺7,干扰素生产工艺路线,上市产品：重组人干扰素,rhuIFN,1986,，,rhuIFN-2a,，,rhuIFN-2b,；,1990,，,rhuIFN-1b,；,1993,，,rhuIFN-1b,；,2001,2002,：,PEG,化,IFN,，,PEG-Intron,Pegasys,表达产物：无糖基化，,N-met,，无活性包涵体,工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程,。,基因工程大肠杆菌发酵生产工艺,:,8,干扰素生产工艺路线上市产品：重组人干扰素rhuIFN基因工程,目的基因的分离,克隆载体,目的基因与克隆载体的体外重组,重组体导入大肠杆菌,K12,受体菌的培养及筛选,从受体菌中获取目的基因,表达载体,重组质粒,导入大肠杆菌,受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测,工,程菌,基因工程菌的制备,9,目的基因的分离克隆载体目的基因与克隆载体的体外重组重组体导,一、目的基因的分离与扩增,1.,破碎细胞，用,Trizol,法提取总的,RNA,2.,将生产干扰素的人白细胞的,mRNA,分级分离然后进行凝胶电泳切取目的基因片段,3.,用逆转录试剂盒逆转录，把总,mRNA,逆转录成,cDNA,4.,以,cDNA,为模板、干扰素引物为引物，,PCR,，得到完全的干扰素基因的,PCR,产物,5.,人工加尾形成“粘性末端”,10,一、目的基因的分离与扩增10,二、构建重组质粒,1.,提取载体（质粒、病毒等），双酶切，再把干扰素基因的,PCR,产物用相应的酶酶切，用连接酶连接,E,co,R I,B,am,H I,E,co,R I,B,am,H I,2.,连接完成后分离纯化，测序，与原干扰素序列比对。,3.,鉴定序列无误后，导入受体细胞，筛选,11,二、构建重组质粒1.提取载体（质粒、病毒等），双酶切，再把,三、重组体引入宿主细胞,将,cDNA,克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质粒中，转化到大肠杆菌，重组的载体,DNA,分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。,12,三、重组体引入宿主细胞 将cDNA克隆到含有四环素,四、受体菌的筛选,由于质粒重组时有,3,种基本方式，即：目的基因与克隆载体重组，目的基因片段与目的基因片段重组，克隆载体与克隆载体重组；另外重组过程可能会发生基因突变情况,13,四、受体菌的筛选 由于质粒重组时有3种基本方式，即：目,五、分析保存,对基因工程大肠杆菌进行评价分析，并保存菌种。,14,五、分析保存 对基因工程大肠杆菌进行评价分析，并保,干扰素的发酵工艺过程,启开种子 制备种子液 发酵培养 粗提,精提 半成品制备 半成品检定 分装,冻干 成品检定 成品包装,15,干扰素的发酵工艺过程15,1,菌种培养,取,70,下保存的甘油管菌种（工作种子批），于室温下融化。然后，接入摇瓶，培养温度,30,，,pH7.0,，,250 r/min,活化培养,182,小时后，进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。,2,种子罐培养,将已活化的菌种接入装有,30L,培养基的种子罐中，接种量,10%,，培养温度,30,，,pH7.0,，级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧为,30%,，培养,3,4,小时，转入发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和,LB,培养基划线检查，控制杂菌,16,1菌种培养 取70下保存的甘油管菌种（工作,3.,发酵罐培养,将种子液通入,300L,培养基的发酵罐中，接种量,10%,，培养温度,30,，,pH7.0,。级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧,30%,，培养,4,小时。然后控制培养温度,20,，,pH6.0,，溶解氧,60%,，继续培养,5,6.5,小时。同时进行发酵液杂菌检查，当,OD,值达,9.01.0,后，用,5,冷却水快速降温至,15,以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中，加入冰块使温度迅速降至,10,以下。,4.,菌体收集,将已降温的发酵液转入连续流离心机，,16000 r/min,离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。菌体于,20,冰柜中保存时，不得超过,12,个月。每保存,3,个月，检查一次活性。,17,3.发酵罐培养 将种子液通入300L培养基的发酵罐中，,3.,干扰素的分离纯化工艺过程,3.1,、干扰素分离工艺过程,3.2,、干扰素的纯化工艺过程,18,3.干扰素的分离纯化工艺过程 3.1、干扰素分离工艺,3.1,干扰素分离工艺过程,菌体裂解,预处理,初级分离,19,3.1 干扰素分离工艺过程19,(1),菌体裂解,裂解缓冲液：纯化水配制，,2,10,（,pH7.5,）,使用保护剂：,EDTA,，,PMSF,。,破碎菌体：,2,厘米以下的碎块,搅拌：加裂解缓冲液，,2,10,，,2hr,冻融,:,细胞完全破裂，释放干扰素。,20,(1)菌体裂解裂解缓冲液：纯化水配制，210（pH7,(2),预处理,-,沉淀,加絮凝剂聚乙烯亚胺,:,2,10,，搅拌,45min,，对菌体碎片进行絮凝。,加凝聚剂醋酸钙溶液,:,2,10,搅拌,15min,，对菌体碎片、,DNA,等进行沉淀。,21,(2)预处理-沉淀加絮凝剂聚乙烯亚胺:21,(3),离心,连续流离心机：,2,10,，,16000 r/min,收集上清液：含有重组干扰素蛋白质,杂质沉淀：,121,、,30min,蒸汽灭菌,焚烧处理。,22,(3)离心连续流离心机：210，16000 r/mi,（,4,）初级分离,盐析,:,硫酸铵，,2,10,，搅匀,静置过夜。,离心：连续流离心机，,16000 r/min,保存：收集沉淀，粗干扰素，,4,保存。,23,（4）初级分离23,3.2,、干扰素纯化工艺过程,溶解粗干扰素,沉淀与疏水层析,阴离子交换层析与浓缩,阳离子交换层析与浓缩,凝胶过滤层析,无菌过滤分装,24,3.2、干扰素纯化工艺过程溶解粗干扰素24,(1),溶解粗干扰素,配制纯化缓冲液：,超纯水，,pH7.5,磷酸缓冲液，,0.45 m,滤器和,10 ku,超滤系统，百级层流下收集。冷却至,2,10,。,检查,:,缓冲液的,pH,值和电导值。,溶解：,2,10,，匀浆，完全溶解。,25,(1)溶解粗干扰素配制纯化缓冲液：25,(2),沉淀与疏水层析,等电点沉淀（,1,）：磷酸调节至,pH5.0,，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。,疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中,除非疏水性蛋白,洗脱与收集：,0.01M,磷酸缓冲液（,pH8.0,）,26,(2)沉淀与疏水层析等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH5.,等电点沉淀（,2,）：磷酸调节,pH4.5,，调节电导值,40 ms/cm,，,2,10,，静置过夜,超滤：,1000 ku,超滤膜过滤，除去大蛋白。,透析除盐：调整溶液,pH 8.0,，电导值，,10 ku,超滤膜，,0.005 M,缓冲液。,27,等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电导值40 ms/,(3),无菌过滤分装,0.22 m,滤膜过滤干扰素溶液,分装,20,以下的冰箱中保存。,28,(3)无菌过滤分装0.22 m滤膜过滤干扰素溶液28,(4),检测项目,干扰素鉴别试验,干扰素效价测定,蛋白质含量，纯度测定，分子量,宿主残余蛋白、残余,DNA,干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，,N,端序列,其他：热原，内毒素，残留抗生素,29,(4)检测项目干扰素鉴别试验29,半成品检定,（,1,）,效价测定,用细胞病变抑制法，以,Wish,细胞、,VSV,病毒为基本检测系统，测定中必须用国家或国际参考品校准为国际单位。,（,2,）,蛋白质含量测定,福林,-,酚法，以中国药品生物制品检定所提供的标准蛋白为标准。,（,3,）,比活性,效价的国际单位与蛋白质含量的毫克数之比。,（,4,）,纯度,电泳纯度用非还原型,SDS-PAGE,法，银染显色应为单一区带，经扫描仪测定纯度应在,95%,以上。,30,半成品检定（1）效价测定 用细胞病变抑制法，以Wi,（,5,）相对分子量测定,还原型,SDS-PAGE,，加样量不地域微克，同时用已知相对分子量的蛋白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对分子量的对数为纵坐标作图，计算相对分子量。与理论值比较，误差不得高于,10%,。,（,6,）残余外源性,DNA,含量测定,用放射性核素或生物素探针法测定，每剂量中残余外源性,DNA,应低于,100pg,。,（,7,）残余血清,IgG,含量测定,在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项检定。,（,8,）残余抗生素活性测定,半成品中不应有抗生素活性存在。,31,（5）相对分子量测定31,（,9,）,紫外光谱扫描,检查半成品的光谱吸收值，最大吸收值应在,2802,纳米。,（,10,）,肽图测定,用,CNBr,裂解法，测定结果应符合干扰素的结构，且批与批之间应一致。,（,11,）,等电点测定,等电聚焦电泳。,（,12,）,除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验和热源质试验。,32,32,成品检定,（,1,）,物理性状,冻干品白色或微黄色疏松体，加入注射水后不得含有肉眼可见不溶物。,（,2,）,鉴别试验,应用,ELISA,或中和试验检定。,（,3,）,水分测定,用卡氏法，应低于,3%,。,（,4,）,无菌试验,同半成品。,33,成品检定（1）物理性状33,（,5,）,热原质试验,同半成品检定。,（,6,）,干扰素效价测定,同半成品检定，效价不应低于标示量。,（,7,）,安全试验,取体重为,350-400,克豚鼠,3,只，每只腹侧皮下注射量为成人每千克体重临床使用最大量的,3,倍，观察,7,天，若豚鼠局部无红肿、坏死、总体重不下降，说明成品合格。取体重,18-20,克小鼠,5,只，每只尾静脉注射剂量按人每千克体重临床使用最大量的,3,倍，观察,7,天，若动物全部存活，说明成品合格。,34,（5）热原质试验34,4,国内基因工程药物产业发展状况,我国的生物技术药物却一直苦于缺乏自主创新的