单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,淀粉酶的分离与纯化（上）,浸提、盐析、透析、浓缩,一、实验目的,1,、掌握蛋白质分离纯化的一般程序。,2,、掌握盐析、透析、浓缩的基本原理与操作。,二、实验原理,蛋白质作为溶液稳定存在的两大因素：,1.,蛋白质颗粒表面大多为亲水基团，可吸引水分子，使颗粒表面形成一层水化膜，从而阻断蛋白质颗粒的相互聚集，防止溶液中蛋白质的沉淀析出；,2.,蛋白质颗粒表面可带相同电荷颗粒之间相互排斥不易聚集沉淀，也可以起稳定颗粒的作用。,若去除蛋白质颗粒这两个稳定因素，蛋白质极易从溶液中沉淀。,盐析是一种与蛋白质的沉淀的性质相关的分离方法：它用硫酸铵、硫酸钠等中性盐来破坏蛋白质在溶液中稳定存在的两大因素，故能使蛋白质发生沉淀。,不同蛋白质分子颗粒大小不同，亲水程度不同，故盐析所需要的盐浓度不同，从而将蛋白质分离。,如用硫酸铵分离清蛋白和球蛋白，在半饱和的硫酸铵溶液中，球蛋白即可从混合溶液中沉淀析出除掉，而清蛋白在饱和硫酸铵中才会沉淀。,盐析的优点是不会使蛋白质发生变性。,三、仪器与试剂,1,、缓冲液：,0.05M,磷酸氢钠缓冲液（,PH7.0,），含,5mmol/l 2-,巯基乙醇，,1mmol/lEDTA,0.5mmol/l,，,PMSF,。,2,、仪器：,离心机，量筒，研钵，,四、实验内容,（一）浸提,采用缓冲液从固态粗酶粉中浸提粗酶液。,称取粗酶粉,2.5g,，加入,20ml,缓冲液，研磨,5-10min,，,3500rpm,离心分离,10min,，收集上清液。,为提高收率，沉渣可加入适量缓冲液再浸提,12,次，离心，合并上清液，即为粗酶液，测定体积。,测定粗酶液的酶活力，计算,总酶活,1,(,酶活力,体积,),（二）分级盐析,根据粗酶液体积，计算出达到相应饱和度需要加入的硫酸铵的量。慢慢的向粗酶液中加入硫酸铵至,30%,饱和度，静置,20min,后，在,12000rpm,的转速下离心,20min,，分别收集上清液与,沉淀,A,。,测量上清液体积，再慢慢向上清液中加入硫酸铵至,70%,饱和度，静置,20min,后，在,12000rpm,的转速下离心,20min,，分别收集上清液与,沉淀,B,。,按同样的方法再次调节硫酸铵饱和度,100%,，静置,20min,后，在,12000rpm,的转速下离心,20min,，分别收集上清液与,沉淀,C,。,收集每一饱和度下沉淀出的蛋白质,（沉淀,A,B,C,），,分别用,5ml,的缓冲液溶解,.,测定组分,A,B,C,的酶活力和蛋白质浓度，以确定淀粉酶主要存在于哪一级的沉淀中，并计算组分,B,的收率。,如果需要，可将采用更细的分级。,组分,B,的收率,=,（,B,的酶活力,B,的体积）,/,总酶活,1,100%,（三）透析,1,、透析袋的预处理：,透析袋的处理主要是除去污染物，特别是重金属和蛋白酶等对蛋白质有毒害作用的物质。可在,0.1mol/l,的,EDTA,溶液中煮,30min,，再换用蒸馏水煮,7,次，每次,20,分钟。,2,、透析：,将所收集的具有酶活力的组分（,组分,B,），放入透析袋，置于清水中，电磁搅拌，透析,24h,，中间换水,3-4,次。为了防止酶失活，整个透析系统应低温放置。,铵离子是否除尽采用,纳氏试剂,检测。,（四）浓缩,透析后，透析袋中液体浓度低，体积较大，可用蔗糖或,PEG6000,包埋浓缩至,1-1.5ml,。取出,0.5ml,测定酶活力，其余的置于冰箱中备下次实验使用。,计算酶活力的收率。,附录,:,调整硫酸铵溶液饱和度计算表（,25,）,